Q1：通过Co-IP后WB验证发现，没有想要的⽬的条带?
A1：1)有可能是样品被蛋⽩酶降解，对应的策略是需要添加蛋⽩酶抑制剂，所有操作保持4℃以下冰上操作并防⽌冻融。
2)有可能是抗体浓度太低导致条带较浅，则需要调整IP或WB抗体浓度，必要时设⽴浓度梯度，摸索最佳浓度。
3)抗体亲和⼒太低，选⽤适合于IP或者WB的抗体。
4)有的IP抗体未与磁珠结合，这种情况需选⽤适合IP的磁珠。
5)若Tag未暴露在融合蛋⽩构象的表⾯，则需改变Tag融合表达部位。
6)裂解液盐碱度太⾼，需⽤低盐碱度的裂解液。
7)抗体选择不当，更换抗体。
Q2：通过Co-IP后WB验证发现，虽然可⻅⽬的条带，但是背景很⾼，原因是什么?
A2：是由多方面原因造成的：
1)由于⾮特异蛋⽩结合导致背景⾼，若要避⾊⾮特异性蛋⽩结合，则需要在⽆⾎清溶液中裂解细胞，且在免疫沉淀前⽤protein(A/G)珠⼦预洗，在免疫沉淀后增加漂洗次数和盐碱度(⾼盐或去垢剂)。
2)实验仪器或试剂被污染，使⽤洁净的仪器及试剂。
3)转移膜上的⾮特异吸附导致背景⾼，实验操作过程中戴⼿套，使⽤镊⼦来取，不要接触膜转移⾯。
4)制备样品中可能有不完全溶解的⼤的蛋⽩复合体，则在制备样品后进⾏短暂超声处理(3次，每次5秒钟)，然后离⼼，取上清后进⾏后续试验。
5)洗涤不彻底，则需要多次洗涤，并增加洗涤液中的NaCl和去垢剂浓度。
6)可能有⾮特异性蛋⽩吸附于珠⼦上，则须进⾏Preclearing以排⾮特异性吸附。
7)抗体本⾝待异性不好可能导致背景⾼，则须选择合适的抗体，可以考虑单抗。
8)使⽤了过多的细胞或组织进⾏裂解导致背景⾼，则须减少样本量，推荐100-500μg细胞裂解液。
9)蛋⽩降解也可能出现⾼背景的情况，尽量使⽤新鲜制备的样品。
蛋白质和核酸是组成生命的主要生物大分子，它们各自具有其结构特征和特定功能。核酸具有传递遗传信息等功能，而蛋白质则贯穿生命的所有生理过程。
来源：网络
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更新时间：2024-10-21