蛋白免疫印迹，简称 Western Blot 或 WB，是检测特定蛋白表达的经典方法。它通过 SDS-PAGE
电泳按分子量分离蛋白，再将蛋白转移到固相膜上，利用一抗和二抗的特异性识别，z终通过化学发光或荧光成像显示目标蛋白条带。
在药物研发、信号通路研究、疾病标志物验证、重组蛋白鉴定和生物制品质控中，WB
常用于回答“这个蛋白是否存在、表达量是否变化、是否发生修饰、是否被剪切或降解”等问题。
WB 的原理
WB 的检测逻辑可以拆成四步：
蛋白分离：SDS 使蛋白变性并带上负电荷，蛋白在聚丙烯酰胺凝胶中按分子量大小迁移。
转膜固定：蛋白从凝胶转移到 PVDF 膜或 NC 膜上，保留电泳分离后的位置信息。
抗体识别：一抗特异性结合目标蛋白，二抗识别一抗并携带酶标或荧光信号。
信号检测：通过化学发光或荧光成像采集条带，结合内参进行半定量分析。
标准 WB 实验流程
1. 样品制备
细胞或组织需在低温条件下裂解，裂解液中通常加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，防止蛋白降解或修饰丢失。 蛋白浓度常用 BCA
法测定，保证各组上样量一致。
2. SDS-PAGE 电泳
根据目标蛋白分子量选择凝胶浓度。小分子蛋白适合较高浓度胶，大分子蛋白适合较低浓度胶。 上样前需加入 Loading Buffer
并加热变性，使蛋白充分解聚。
3. 转膜
常用 PVDF 膜或 NC 膜。PVDF 膜使用前需用甲醇活化，NC 膜直接润湿即可。 小分子蛋白可选半干转，大分子蛋白通常更适合湿转。
转膜后可用丽春红染色确认转膜是否成功。
4. 封闭
用脱脂奶粉或 BSA 封闭膜上非特异性结合位点，降低背景。磷酸化蛋白检测通常优先选择 BSA 封闭，避免奶粉中酪蛋白干扰。
5. 抗体孵育
一抗孵育通常选择 4℃ 过夜，有利于提高特异性和降低背景。 二抗需与一抗种属匹配，如兔源一抗搭配抗兔二抗。
孵育后需充分洗膜，减少非特异性结合。
6. 显影与分析
化学发光法灵敏度高，适合低丰度蛋白检测;荧光法适合多重检测，可在同一张膜上同时检测多个靶标。
条带灰度值可用于半定量分析，但需以内参校正上样误差。
内参抗体如何选择
内参用于校正上样量和转膜差异，常用内参包括：
β-actin：适合多数胞浆蛋白检测;
GAPDH：常用于胞浆内参，但在缺氧、代谢干预等条件下可能变化;
α-Tubulin：适合胞浆或细胞骨架相关研究;
Lamin B1、Histone H3：适合核蛋白内参;
Na⁺/K⁺-ATPase：适合膜蛋白内参。
选择内参时，需确认其在实验处理条件下表达稳定，且分子量与目的蛋白不重叠。
常见问题与排查思路
无信号或信号弱
可能原因包括样本不表达目的蛋白、上样量不足、转膜失败、一抗不匹配或失效、二抗种属不匹配、曝光时间不足。
可先用丽春红染色确认转膜效果，再用阳性对照验证抗体活性。
背景过高
常见原因包括封闭不充分、抗体浓度过高、洗膜不彻底、曝光时间过长或膜干燥。
可延长封闭时间、降低抗体浓度、增加洗膜次数，并避免膜在孵育过程中干燥。
杂带或多条带
可能来自蛋白剪切体、翻译后修饰、二聚体/多聚体、蛋白降解、上样量过高或抗体浓度过高。
若条带呈规律性倍数分布，需考虑多聚体;若出现低分子量拖尾，需重点排查蛋白降解。
条带大小与理论值不符
可能原因包括磷酸化、糖基化等翻译后修饰，前体蛋白剪切，剪接变体，蛋白多聚体，或不同亚型表达。 也可通过查阅 UniProt
或文献确认目的蛋白是否存在修饰位点和异构体。
条带歪斜或转膜不均
通常与转膜夹未压紧、气泡未排尽、滤纸和膜裁剪不一致、转膜液未完全浸没有关。 组装转膜“三明治”结构时应从一侧缓慢推压，彻底排除气泡。
化学发光法与荧光法对比
化学发光法灵敏度通常更高，适合低丰度蛋白检测和长时间曝光，但信号持续时间有限，多次曝光时需及时更换底物。
荧光法信号稳定、重现性较好，适合多重检测和定量分析，但需要配套荧光成像系统，并注意避免荧光污染。
送样与检测建议
若委托第三方开展 WB 检测，建议提前确认以下信息：
样本类型：细胞、组织、血清、上清或纯化蛋白;
样本量：细胞通常需 10⁶ 个以上，组织通常需 50–200 mg 以上，具体以检测机构要求为准;
保存方式：新鲜样本应快速液氮速冻或加入稳定剂，-80℃ 保存，干冰运输，避免反复冻融;
抗体信息：目的蛋白种属、分子量、是否磷酸化/修饰、是否已有验证抗体;
内参选择：根据样本类型和实验处理选择稳定内参;
交付内容：原始条带图、内参图、灰度分析、实验条件和完整报告。
来源：网络
当前位置： 新闻动态 > 行业信息 
更新时间：2026-11-04