MTT细胞毒性实验原理及操作流程

　　MTT(噻唑蓝)细胞毒性测试是生物学和药物研发中评估化合物对细胞毒性效应的经典比色法。该方法具有灵敏度高、经济高效的特点，广泛应用于抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验及生物活性因子检测等领域。

　　一、 实验原理

　　MTT全称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，是一种黄色染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶(NAD(P)H依赖性氧化还原酶)能将外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)，并沉积在细胞中;而死细胞无此功能。随后，加入二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂溶解甲臜，通过酶标仪在特定波长(如490 nm或570 nm)处测定吸光度(OD值)。在一定细胞数范围内，甲臜的生成量与活细胞数量成正比，从而间接反映细胞毒性。

　　二、 标准操作流程

　　1. 细胞接种与培养 收集对数生长期细胞，制备成单细胞悬液。根据实验目的调整接种密度(通常增殖实验每孔2000个，细胞毒性实验每孔5000-10000个)，接种至96孔板中(每孔100 μL)。将培养板置于37℃、5% CO₂培养箱中孵育，待细胞贴壁或达到预期汇合度。

　　2. 药物处理 在EP管中预先配制好不同浓度梯度的药物(建议设置5-7个浓度梯度，每个浓度设3-5个复孔)。吸去96孔板中的旧培养液，加入含药培养基继续孵育16-48小时。同时需设置对照孔(仅含细胞与等量溶剂)和空白调零孔(仅含培养基)。

　　3. MTT呈色反应 每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，终浓度约0.5 mg/mL)，继续避光孵育4小时。若药物本身会与MTT发生反应，需先离心弃去培养液，用PBS洗涤2-3遍后再加入含MTT的新鲜培养液。

　　4. 溶解结晶与比色 小心吸弃孔内上清液(悬浮细胞需先离心)。每孔加入100-150 μL DMSO(或专用三联溶解液)，在摇床上低速振荡10分钟，使紫色结晶充分溶解。使用酶标仪在490 nm或570 nm波长下测定各孔吸光度。

　　三、 结果计算与分析

　　细胞存活率 = [(As - Ab) / (Ac - Ab)] × 100%

　　细胞抑制率 = [(Ac - As) / (Ac - Ab)] × 100% (注：As为实验孔OD值，Ac为对照孔OD值，Ab为空白孔OD值)

　　通过绘制药物浓度与细胞存活率/抑制率的剂量-效应曲线，可利用改良寇式法或GraphPad Prism等软件计算出半数抑制浓度(IC50)，以此量化评估物质的细胞毒性程度。

　　四、 关键注意事项

　　MTT溶液配制与保存：MTT需用PBS(pH 7.4)配制成5 mg/mL，经0.22 μm滤膜过滤除菌后避光保存。若MTT溶液变为灰绿色则已失效，不可使用。

　　避免假阳性/假阴性：培养基中应避免含有硫醇类化合物(会将MTT直接转化为甲臜);若使用含酚红培养基，需设置相应的背景扣除孔。

　　结晶溶解操作：使用DMSO溶解前，务必将孔内液体吸净，否则残留液体会导致甲臜结晶难以溶解，影响OD值测定。

　　局限性：MTT法仅能反映细胞的相对代谢活性和相对数量，无法测定细胞的绝对数目。此外，溶解甲臜的有机溶剂对实验人员有一定毒性，建议在通风橱中操作。

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