SPR实验的具体操作步骤

　　表面等离子共振(SPR)实验的核心流程通常可以概括为“配体固定 - 分析物结合 - 芯片再生 - 数据分析”的闭环。下面是标准化的具体操作步骤：

　　一、 实验前准备

　　仪器调试：开机预热SPR仪，完成光源、检测器、温控及进样系统的自检。设定实验温度(常规25℃，生化实验可选37℃)，打开配套软件建立实验项目。

　　试剂处理：配制运行缓冲液(如HBS-EP、PBS)，使用0.22μm滤膜过滤并超声脱气。将配体和分析物稀释至适宜浓度，所有试剂平衡至实验设定温度。

　　芯片准备：选择适配的传感芯片(如CM5羧基化芯片)，检查无划痕后正确装入仪器卡槽，运行Prime程序冲洗内部流路。

　　二、 芯片活化

　　以10μL/min的流速向检测通道注入新鲜混合的EDC/NHS活化液(如200mM EDC + 50mM NHS，1:1体积比)，进样体积约50-100μL，活化5-10分钟。此步骤旨在激活芯片表面的羧基为活性酯基团，活化后需立即进入下一步。

　　三、 配体固定与封闭

　　配体偶联：以10μL/min流速向检测通道注入稀释后的配体溶液(参比通道仅注缓冲液)，实时监测共振单位(RU)值，待达到预期固定量(蛋白类通常为1000-5000 RU)后停止进样。

　　表面封闭：立即向检测通道注入1M乙醇胺(pH 8.5)，进样50-100μL，封闭5分钟。此步骤用于封闭芯片表面未结合的剩余活性基团，防止后续非特异性结合。

　　基线平衡：用运行缓冲液持续冲洗通道，直至检测通道与参比通道的SPR信号稳定(波动≤±1 RU)。保持设定流速(如30μL/min)冲洗10-20分钟，确认基线平稳后记录初始RU值。

　　四、 分析物结合与解离检测

　　结合阶段：将分析物设3-5个梯度浓度(含空白缓冲液对照)，按从低到高浓度顺序，以30μL/min流速依次向双通道进样(体积100-200μL)，记录RU值随时间上升的结合信号。

　　解离阶段：分析物进样完成后，继续注入运行缓冲液进入解离阶段(通常10-30分钟)，记录RU值随时间下降的解离信号。

　　冲洗：每个浓度检测完成后，用缓冲液冲洗通道至信号恢复基线，再进行下一个浓度检测，避免样品残留干扰。

　　五、 芯片再生

　　根据分子相互作用强弱，选择适配的再生液(如低pH缓冲液、高盐缓冲液等)，以30μL/min流速进样50-100μL，再生2-5分钟以解离芯片表面结合的分析物。再生后用缓冲液冲洗，若信号未恢复至初始基线水平，可重复再生1-2次，仍未恢复则需更换芯片。

　　六、 实验后处理与数据分析

　　系统清洗：样品检测完毕后，用运行缓冲液冲洗芯片和进样管路15-20分钟，彻底清除残留试剂。

　　芯片保存：短期保存置于无菌芯片盒中4℃冷藏;长期停机则用超纯水冲洗管路后吹干。

　　数据处理：关闭仪器模块并保存原始数据。后续通过软件进行数据校正(扣除参比通道信号)、曲线拟合，计算亲和力常数(KD)、结合常数(Ka)、解离常数(Kd)等参数。

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