SPR氨基偶联分步操作指南

　　表面等离子共振(SPR)技术中，氨基偶联法是常用、稳定的配体固定方式。该方法通过化学反应将配体永久共价偶联于芯片表面，适用于稳定且纯度高的配体(如含有伯胺基团的蛋白)。下面是基于主流仪器的标准化氨基偶联分步操作指南：

　　一、 实验前准备

　　仪器与系统调试：开机预热SPR仪，完成光源、检测器、温控及进样系统的自检。设定实验温度(常规25℃，生化实验可选37℃)。

　　缓冲液与试剂准备：

　　配制运行缓冲液(如HBS-EP或PBS)，使用0.22μm滤膜过滤并超声脱气。

　　准备氨基偶联试剂盒(包含EDC、NHS、乙醇胺)以及用于配体稀释的醋酸钠缓冲液(常用pH 4.0/4.5/5.0)。

　　芯片安装：选择适配的传感芯片(如CM5羧基化芯片)，手持芯片将有字的一面朝上，按箭头方向轻轻推入卡槽并合上舱门。随后运行Prime程序，用缓冲液冲洗内部流路。

　　二、 芯片活化

　　以10μL/min的流速，向检测通道注入新鲜混合的EDC/NHS活化液(通常为1:1体积比，如200mM EDC + 50mM NHS)。进样体积约50-100μL，活化时间控制在5-10分钟。此步骤旨在激活芯片表面葡聚糖基质上的羧基，使其形成活性的NHS酯基团。活化后需立即进入下一步，避免活性基团失活。

　　三、 配体固定(偶联)

　　将配体蛋白用醋酸钠缓冲液稀释至适宜浓度(如10-50μg/mL)，以10μL/min的流速注入检测通道。配体上的伯胺基团会与活化的NHS酯反应，形成稳定的酰胺键。实时监测软件上的共振单位(RU)值，待RU达到预期固定量(蛋白类通常为1000-5000 RU)后，立即停止进样。

　　四、 表面封闭

　　迅速向检测通道注入1M乙醇胺(pH 8.5)，进样50-100μL，封闭5分钟左右。此步骤至关重要，用于封闭芯片表面未反应的剩余活性基团，防止后续实验中分析物发生非特异性结合。

　　五、 基线平衡与验证

　　封闭完成后，用运行缓冲液持续冲洗通道，直至检测通道与参比通道的SPR信号稳定(波动≤±1 RU)。保持设定流速(如30μL/min)，向双通道持续注入缓冲液10-20分钟，观察基线无漂移、无杂峰。确认基线平稳后，记录初始RU值，作为后续检测的基准。

　　六、 注意事项

　　缓冲液禁忌：配体稀释液及运行缓冲液中绝对不能含有Tris等伯氨基团，否则会消耗活化试剂，严重降低偶联效率。

　　pH值调节：为提高固定效率，配体溶液pH需调节至高于3.5(芯片表面羧基pKa)且低于配体等电点(pI)，使配体通过静电吸附预富集在芯片表面。

　　避免气泡：全程需避免气泡进入管路或芯片，气泡会导致信号出现尖峰干扰。

　　固定量控制：配体固定量不宜过高，以防产生空间位阻，影响后续分析物分子的结合。

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