电镜超薄切片制备方法步骤

　　电镜超薄切片制备是透射电子显微镜(TEM)观察的核心前处理技术，主要用于生物软组织、高分子材料、橡胶、纳米颗粒等“软”样品。

　　由于电子束的穿透能力有限(通常只能穿透几十到几百纳米的厚度)，样品必须被切成极薄的切片(通常厚度在 50-100 nm 之间)，才能让电子穿透并成像。

　　整个制备流程可以形象地理解为将柔软的样品“硬化”并“切片”的过程。下面是标准的制备步骤详解：

　　流程概览

　　无论是生物样品还是高分子材料，常规超薄切片通常遵循以下 6个关键步骤：

　　取材 → 固定 → 脱水 → 包埋 → 切片 → 染色

　　详细操作步骤

　　1. 取材

　　这是第一步，也是决定样品质量的基础。

　　原则：快、小、准、冷。

　　快：样品离体后要迅速放入固定液，防止自溶。

　　小：体积要小(通常约为 1 mm³)，因为固定液渗透能力有限，过大无法固定透彻。

　　准：定位准确，针对特定区域取样。

　　冷：操作通常在低温(0-4℃)下进行，以抑制酶活性。

　　2. 固定

　　目的是用化学试剂“锁住”样品的微观结构，使其保持生活状态下的形态，防止在后续处理中腐败或变形。

　　双重固定法(生物样品常用)：

　　前固定：使用 2.5% 戊二醛。它能很好地保存蛋白质和酶的结构。

　　后固定：使用 1% 锇酸。它能固定脂类和膜结构，并具有电子染色作用(增加反差)。

　　漂洗：固定前后需用缓冲液(如磷酸缓冲液)充分漂洗，去除残留试剂。

　　3. 脱水

　　包埋剂通常是疏水的(不溶于水)，因此必须用有机溶剂将样品内部的水分完全置换出来。

　　方法：采用梯度浓度脱水，避免剧烈收缩。

　　常用试剂：乙醇或丙酮。

　　流程示例：30% → 50% → 70% → 80% → 90% → 100% 乙醇，z后用100%丙酮过渡。

　　4. 渗透与包埋

　　为了让样品有足够的硬度以便切割，需要用树脂填充样品内部并固化。

　　渗透：使用“包埋剂+脱水剂”的混合液，按比例(如1:1, 3:1)逐步增加包埋剂浓度，让树脂慢慢渗入样品。

　　包埋与聚合：将样品放入纯包埋剂(如环氧树脂 Epon 812)中，置于模具内，在 60-70℃ 烘箱中加热过夜，使树脂聚合固化成坚硬的塑料块。

　　5. 超薄切片

　　这是精细的一步，需要使用专门的超薄切片机。

　　修块：在显微镜下将包埋块顶端修成梯形或金字塔形，暴露出样品。

　　切片：

　　刀具：使用玻璃刀或钻石刀(金刚石刀)。

　　水槽：刀后有一个水槽，切下的切片会漂浮在水面上形成切片带。

　　厚度：通常设定为 70-90 nm。

　　捞片：用涂有支持膜(如火棉胶)的铜网将漂浮的切片捞起。

　　6. 电子染色

　　生物样品主要由轻元素(C, H, O, N)组成，对电子散射能力弱，图像反差差，必须用重金属盐进行染色。

　　常用染液：醋酸铀(铀染)和柠檬酸铅(铅染)。

　　作用：重金属离子与细胞结构结合，增加电子散射，使图像黑白分明(如膜结构变黑)。

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