BCA法测蛋白浓度实验原理及操作步骤

　　BCA(Bicinchoninic Acid，二辛可宁酸)法是目前实验室中常用的蛋白浓度检测方法之一。它以其高灵敏度、操作简便、抗干扰能力强(特别是对去污剂)而著称，是替代传统Lowry法和Bradford法的理想选择。

　　实验原理

　　BCA法的核心反应分为两步：

　　还原反应：在碱性环境下，蛋白质将二价铜离子(Cu²⁺)还原为一价铜离子(Cu⁺)。蛋白质中的肽键以及半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸等残基参与了这一还原过程。

　　显色反应：生成的一价铜离子(Cu⁺)与BCA试剂结合，形成稳定的紫色络合物。

　　该紫色络合物在 562 nm 波长处有z大吸收峰。在一定范围内，吸光度值与蛋白质浓度呈线性关系，通过对比标准曲线即可计算出样品浓度。

　　试剂与准备

　　BCA试剂盒：通常包含试剂A(含BCA钠盐、碳酸钠等)和试剂B(硫酸铜溶液)。

　　蛋白标准品：通常使用牛血清白蛋白(BSA)，浓度常为 2 mg/mL。

　　待测样品：需确保样品溶解液与标准品稀释液一致(如PBS或水)。

　　仪器：酶标仪(推荐)或分光光度计、恒温培养箱(37°C)。

　　操作步骤(以96孔板法为例)

　　1. 配制BCA工作液

　　根据样品和标准品的数量计算所需体积。

　　配比：将 试剂A : 试剂B = 50 : 1 混合。

　　注意：混合后若出现绿色沉淀，可摇匀溶解;工作液室温下24小时内稳定。

　　2. 稀释标准品

　　将2 mg/mL的BSA标准品用缓冲液稀释成一系列浓度梯度。常用的标准曲线范围是 20-2000 μg/mL。

　　例如：0, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 μg/mL。

　　建议每个浓度做2-3个复孔。

　　3. 加样

　　标准品：每孔加入 20-25 μL 标准品。

　　样品：每孔加入 20-25 μL 待测样品(若样品浓度过高，需预先稀释)。

　　空白对照：加入等体积的稀释缓冲液。

　　4. 加工作液与孵育

　　每孔加入 200 μL BCA工作液(样品:工作液比例约为 1:8 到 1:10)。

　　轻轻振荡混匀，避免产生气泡。

　　孵育条件：

　　37°C 孵育 30 分钟(常用，显色快)。

　　或 室温(25°C)孵育 2 小时。

　　5. 检测

　　冷却至室温(若在高温下孵育)。

　　使用酶标仪测定 562 nm 处的吸光度值(OD值)。

       来源：网络