MTT实验甲臜结晶溶解不完全怎么办

　　MTT实验中甲臜(Formazan)结晶溶解不完全是一个非常常见的问题，这会导致检测的OD值偏低，且孔内不均一，严重影响实验数据的准确性。

　　1. 物理助溶(直接的方法)

　　延长振荡时间：加入DMSO后，不要静止放置。将96孔板放在摇床上低速振荡10-15分钟。如果结晶较多，可以适当延长振荡时间。

　　移液枪吹打：这是有效的手段之一。使用移液枪反复吹吸孔内液体，利用液体的冲击力帮助结晶溶解。特别是对于细胞密度较高、结晶堆积严重的孔，吹打能显著加速溶解。

　　温热孵育：DMSO在低温下粘度大且溶解能力下降。

　　可以在加入DMSO前将其37℃预热。

　　或者加入DMSO溶解后，将孔板放入37℃培养箱中孵育10-15分钟，利用温度加速溶解。

　　2. 优化溶剂与用量

　　确保DMSO足量：一般96孔板每孔建议加入100-150 μL的DMSO。如果细胞接种密度高，产生的结晶多，可以适当增加DMSO的体积。

　　检查DMSO状态：DMSO在低温下会凝固，使用前请确认其完全融化且为液态。

　　更换溶解液：如果DMSO效果不佳，可以尝试使用酸化异丙醇(0.04M HCl in isopropanol)或10% SDS-50% DMF溶液。有些试剂盒自带的溶解液对某些细胞类型的结晶溶解效果更好。

　　3. 源头控制(预防结晶过多)

　　如果结晶大到难以溶解，说明MTT反应产生的沉淀过多，可以从源头进行调整：

　　调整细胞密度：细胞密度过高会导致结晶堆积成团。建议适当降低接种细胞数(例如从10000个/孔降至5000个/孔)，使结晶分布更均匀，易于溶解。

　　控制MTT孵育时间：MTT反应时间过长(如超过4小时)会产生过量结晶。可以尝试缩短MTT孵育时间(如2-3小时)，在显微镜下观察到有紫色结晶析出即可终止。

　　4. 操作细节避坑

　　彻底吸除上清：在加入DMSO之前，必须彻底吸净孔内的培养基。残留的培养基会稀释DMSO，导致溶解效率大幅下降，甚至产生浑浊。

　　技巧：对于贴壁不牢的细胞，可以先离心(如2000rpm，5分钟)再吸上清，防止吸走结晶。

　　避光操作：甲臜结晶对光敏感，溶解过程应尽量避光，防止分解导致读数不准。

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