ITC与SPR在实验操作上有何区别？

　　等温滴定量热法 (ITC) 和 表面等离子体共振 (SPR) 虽然都用于测定分子间相互作用(如亲和力 KD​ )，但它们的物理原理截然不同，导致在实验操作流程、样品准备、仪器设置和数据解读上存在巨大差异。

　　具体实验操作步骤对比

　　1. 样品准备 (Sample Preparation)

　　ITC:

　　脱气 (Degassing)：必须步骤。样品缓冲液必须严格脱气，防止微量气泡在搅拌或温度变化时产生噪音(放气峰)。

　　精确匹配缓冲液：参比池(Reference Cell)和样品池(Sample Cell)中的缓冲液成分必须完全一致(包括pH、盐浓度、甚至DMSO比例)，否则会产生巨大的稀释热背景。通常需要将蛋白透析到同一缓冲液中，而不是简单稀释。

　　浓度要求高：为了获得准确的 cc 值( c=Ka×[M]c=Ka​×[M] )，通常需要较高的浓度(μM级别)，样品消耗量较大(几百微升)。

　　过滤：需0.22 μm过滤，防止颗粒堵塞注射针。

　　SPR:

　　缓冲液筛选：重点在于寻找适合固定化和再生的缓冲液(如低pH醋酸钠用于偶联，Glycine-HCl用于再生)。

　　无需脱气：现代SPR仪器内置在线脱气机，但样品z好离心去除大颗粒。

　　浓度范围广：可测浓度范围极宽(pM to mM)，样品消耗量少(几十微升)。

　　DMSO匹配：如果样品含有机溶剂，需精确匹配运行缓冲液中的溶剂浓度。

　　2. 仪器设置与加载 (Instrument Setup & Loading)

　　ITC:

　　装样：用微量注射器将受体(大分子，通常在池子里)注入样品池;将配体(小分子/多肽，通常在针筒里)装入注射器。

　　平衡：仪器需长时间恒温平衡(通常30-60分钟)，直到基线热功率稳定(< 0.1 μcal/s)。

　　参数设定：设定注射次数(通常15-25次)、注射体积(首针通常较大以排除扩散影响，后续等体积)、注射间隔时间(需足够长让信号回到基线，通常120-300秒)。

　　搅拌：必须开启搅拌(通常300-1000 rpm)以确保混合均匀和热传递。

　　SPR:

　　芯片安装：安装传感器芯片(如CM5, SA, NTA等)。

　　流路活化：这是ITC没有的步骤。需注入活化剂(EDC/NHS)活化芯片表面。

　　固定化 (Immobilization)：注入配体溶液进行偶联，然后注入封闭剂(乙醇胺)。这一步决定了实验成败，需优化pH和浓度。

　　流路设置：设定流速(通常10-50 μL/min)、进样时间(Association)、解离时间(Dissociation)。

　　参考通道：必须设置一个参考通道(Reference Cell)用于扣除非特异性结合和折射率波动。

　　3. 运行过程 (Running the Experiment)

　　ITC:

　　过程：仪器自动执行一系列注射。每次注射都会产生一个热峰(吸热向下，放热向上)。

　　耗时：单次实验较长，通常 1.5 - 3 小时。因为每次注射后必须等待热量平衡回到基线才能进行下一次。

　　监控：实时观察热峰高度是否逐渐降低(饱和过程)。

　　SPR:

　　过程：液体连续流动。先走缓冲液建立基线 -> 切换为含分析物的样品(结合相，曲线上升) -> 切换回缓冲液(解离相，曲线下降) -> 注入再生液(洗脱，曲线归零)。

　　耗时：单个循环很快(几分钟)，但通常需要跑 5-7个不同浓度 的梯度，加上再生和平衡，总时长约 1 - 2 小时。

　　自动化：易于实现高通量，可自动连续进样几十个样品。

　　4. 数据处理 (Data Analysis)

　　ITC:

　　积分：将每个热峰的面积积分，得到每次注射的总热量 ( ΔQ )。

　　拟合：绘制“结合等温线”(每摩尔注入配体的热量 vs. 摩尔比)。

　　输出：一次性拟合得到 KD​ (亲和力), ΔH (焓变), ΔS (熵变), n (化学计量比)。

　　难点：如果 c 值不合适(太陡或太平)，无法拟合;如果有沉淀或气泡，数据作废。

　　SPR:

　　双参考扣除：先扣除参考通道信号，再扣除零浓度循环信号(Double Referencing)。

　　拟合模型：选择动力学模型(如1:1 Langmuir, Two-state等)拟合结合和解离曲线。

　　输出：先得到动力学常数 kon (结合速率) 和 koff (解离速率)，然后计算 KD=koff/kon 。

　　难点：质量传输限制(Mass transport limitation)、非特异性结合、再生不彻底导致的基线漂移。

       来源：网络