血清样本高丰度蛋白去除技术方法

　　在血清/血浆蛋白质组学中，高丰度蛋白去除(High-Abundance Protein Depletion, HAPD) 是检测低丰度生物标志物(如细胞因子、激素、早期肿瘤标志物)的必经之路。

　　人血清中前6-10种高丰度蛋白(主要是白蛋白和免疫球蛋白)占据了总蛋白质量的 90%-95%，严重抑制了质谱对低丰度蛋白的检测动态范围。

　　主流技术方法

　　1. 免疫亲和层析法 (Immunoaffinity Chromatography) —— 金标准

　　这是目前成熟、应用广泛的方法。

　　原理：将针对高丰度蛋白的特异性多克隆或单克隆抗体偶联到固相载体(树脂/磁珠)上。当血清流过时，高丰度蛋白被抗体特异性捕获，流穿液(Flow-through)即为去除了高丰度蛋白的样本。

　　形式：

　　离心柱 (Spin Columns)：适合少量样本，操作简便。

　　HPLC/UPLC 在线柱：直接连接液相色谱系统，实现自动化高通量处理。

　　磁珠 (Magnetic Beads)：适合自动化工作站，处理通量高。

　　代表产品：

　　Agilent MARS (Multiple Affinity Removal System): 行业标杆，有Top 6, Top 14等多种规格。

　　Thermo Fisher Pierce: Top 2, Top 6, Top 12 Abundant Protein Depletion kits。

　　Sigma/Merck: Seppro kits。

　　优点：去除效率高(>95%)，特异性好，重复性高。

　　缺点：成本高;存在“连带效应”(见下文)。

　　2. 组合配体库技术 (Combinatorial Peptide Ligand Libraries, CPLL) —— “均一化”神器

　　原理：使用包含数十亿种不同六肽序列的文库(如ProteoMiner)。

　　高丰度蛋白：迅速饱和有限的结合位点，过量部分被洗掉。

　　低丰度蛋白：找到特异性结合位点并被富集浓缩。

　　效果：不仅去除了高丰度蛋白，还浓缩了低丰度蛋白，实现了样本蛋白浓度的“均一化”(Normalization)。

　　代表产品：Bio-Rad ProteoMiner。

　　优点：能发现更多极低丰度蛋白;无需知道具体要去除哪些蛋白;同时起到浓缩作用。

　　缺点：操作相对复杂(需要优化洗脱条件);回收率波动较大;可能引入肽段干扰后续质谱分析。

　　3. 物理化学沉淀法 (Physical/Chemical Precipitation)

　　原理：利用有机溶剂(乙腈、甲醇)、酸或特定聚合物选择性沉淀高丰度蛋白或沉淀所有蛋白后复溶(间接富集低丰度)。

　　常见方法：

　　有机溶剂沉淀：乙腈沉淀白蛋白。

　　PEG沉淀：聚乙二醇沉淀大分子蛋白。

　　商业试剂盒：如Exosome排除后的上清处理。

　　优点：成本极低，操作简单，无抗体依赖。

　　缺点：特异性差，容易共沉淀低丰度蛋白;回收率不稳定;可能引入杂质干扰质谱。

　　适用：预算有限或对定量精度要求不极高的筛选实验。

　　4. 尺寸排阻色谱 (Size Exclusion Chromatography, SEC)

　　原理：基于分子大小分离。虽然不能直接“去除”白蛋白(因为它也是中等大小)，但常用于外泌体/囊泡富集，从而间接去除游离的高丰度血清蛋白(因为游离蛋白在外泌体流穿液中，或者反之，取决于收集组分)。

　　适用：专门针对外泌体蛋白组学研究。

       来源：网络