小分子与蛋白相互作用实验

　　小分子与蛋白相互作用实验是药物发现、靶点验证、机制研究和化学生物学的核心技术。其目标是确认小分子是否结合靶蛋白、结合强度(亲和力)、结合位点及功能影响。

　　一、初筛：确认是否发生相互作用

　　1. 表面等离子共振(SPR, Surface Plasmon Resonance)

　　原理：小分子流过固定在芯片上的蛋白，引起折射率变化 → 实时监测结合/解离。

　　输出：

　　KD(解离常数) = koff/kon

　　结合动力学(快结合/慢解离为优)

　　优点：无需标记、实时、定量，金标准之一。

　　灵敏度：KD 范围 10−3 – 10−12 M

　　设备：Biacore(Cytiva)、OpenSPR(Nicoya)

　　注意：蛋白需高纯度(>90%)，避免非特异吸附。

　　2. 等温滴定量热法(ITC, Isothermal Titration Calorimetry)

　　原理：滴定小分子到蛋白溶液中，测量热释放/吸收。

　　输出：

　　KD、ΔH(焓变)、ΔS(熵变)、化学计量比(n)

　　优点：直接测热力学参数，无需固定或标记。

　　缺点：样品消耗大(μmol级)，低亲和力(KD > 100 μM)难测。

　　设备：MicroCal PEAQ-ITC(Malvern)

　　3. 荧光偏振/各向异性(FP/FA)

　　适用：小分子带荧光或可标记。

　　原理：小荧光分子旋转快 → 偏振低;结合大蛋白后旋转变慢 → 偏振升高。

　　优点：高通量(96/384孔板)，适合筛选。

　　局限：需荧光标记，可能影响结合。

　　二、细胞/溶液环境验证

　　4. 热 shift assay(TSA, 热稳定性迁移实验)

　　别名：CETSA(Cellular Thermal Shift Assay)

　　原理：小分子结合使蛋白热稳定性↑ → 高温下不易变性沉淀。

　　操作：

　　细胞或裂解液 + 小分子 → 梯度加热(45–65℃)→ 离心 → WB 检测上清蛋白量。

　　优点：可在细胞内验证结合，接近生理环境。

　　升级版：MS-CETSA(质谱检测全蛋白质组热稳定性变化)

　　5. 生物层干涉技术(BLI, Bio-Layer Interferometry)

　　原理：类似 SPR，但用光纤传感器(如 ForteBio Octet)。

　　优点：无需微流控，操作简单，适合粗提物。

　　应用：快速测 KD，验证抗体-抗原、小分子-蛋白。

　　三、定位结合位点与结构信息

　　6. X射线晶体学(X-ray Crystallography)

　　输出：原子分辨率复合物结构(Å级)

　　要求：蛋白-小分子复合物能结晶。

　　价值：指导结构优化(如 SAR by crystallography)

　　7. 核磁共振(NMR)

　　方法：

　　STD-NMR(Saturation Transfer Difference)：确认小分子哪些基团接触蛋白;

　　15N-HSQC：观察蛋白骨架化学位移扰动。

　　优点：溶液态、动态信息。

　　缺点：蛋白需同位素标记，分子量 < 50 kDa 较佳。

　　8. 氢氘交换质谱(HDX-MS)

　　原理：蛋白在 D2O 中，暴露区域 H 快速交换为 D;结合小分子后，结合区交换减慢。

　　输出：肽段水平定位结合界面。

　　优势：无需结晶，适用于大蛋白/复合物。

       来源：网络